MS/MSイオンサーチ法
プルダウン後のSDS-PAGEや二次元電気泳動などでも複数のタンパク質が共存する場合には、MS/MSイオンサーチ法による同定が極めて有効です。
２次元電気泳動法のようなタンパク質の分離能に優れた方法によって処理した場合でも、多くの場合、切り出したゲル片内には複数のタンパク質が含まれています。また、特定のタンパク質に非共有的に結合する複合体の構成タンパク質を解析する場合には、プルダウン処理によって得られるタンパク質複合体をSDS-PAGEによって分離します。この場合も、バンド中には複数のタンパク質が含まれています。このような複数のタンパク質が共存する場合には、MS/MSイオンサーチ法による同定が極めて有効です。MS/MS法を実施するためには、２つの質量分析計をタンデムに連結し、その間に特定のイオンのみを選択するためのイオンセレクターが配置されているタンデム型の質量分析計を利用します。TOFTOF質量分析計の場合では、１段階目のTOFでイオンを分離し、特定のイオンがイオンセレクターに到達する直前にセレクター電圧を切り、目的イオンが通過した後にセレクター電圧をオンとすることにより、目的イオンのみを通過させる。目的イオンはコリージョンセル内で不活性ガスとの衝突により崩壊させた後、再度加速され２段目のTOFで分離されます。コリージョンセル内での崩壊では、主としてペプチドの骨格構造がランダムに切断されるので、MS/MSスペクトルには目的ペプチドのアミノ酸配列に関する情報が表現されます。
例えば、５残基の連続したアミノ酸配列が決定できた場合、ロイシンとイソロイシンおよびリジンとグルタミンの判別が可能と仮定すれば、２０５種類のアミノ酸配列の中から１種類に絞り込むことになります。多くの場合、特定のタンパク質から複数のペプチドの部分配列を解析できますので、高い精度でタンパク質の同定が可能となります。
電気泳動後のゲル処理から脱塩処理までの方法は、PMF法で紹介した方法と同様です。
- MS/MS分析により個々のペプチドのMS/MSフラグメントの質量情報を得る。
- データベース検索により、タンパク質データベースに存在する個々のタンパク質のトリプシン消化ペプチドのMS/MSフラグメントの理論値と実測値を比較し、適合率の高いものを選ぶ。
MS/MSイオンサーチ法の原理