レポータージーンアッセイ
核内受容体のリガンド探索法には２つの方法があり、単離、精製された核内受容体を用いるバインディングアッセイ、組換体細胞を用いたレポータージーンアッセイの2つに大きく分けられます。
先に述べたように、核内受容体は、1．リガンドと結合、2．特定のDNA配列と結合、3．下流の遺伝子の転写を活性化という3つのステップにより、機能を発揮する転写因子です。バインディングアッセイは、核内受容体のリガンドとの結合性を評価するに過ぎないため、「1．リガンドと結合」の評価をすることはできますが、最終的に転写活性を持つかについては、評価できません。また、核内受容体のリガンドとなりうる物質は、細胞膜を容易に通過できることが必要ですが、バインディングアッセイでは細胞に取り込まれるまでの過程が評価できません。したがって、バインディングアッセイで核内受容体への結合性が証明されたにもかかわらず、細胞への透過性が悪いためリガンドとして機能できない物質の存在が問題となります。
一方のレポータージーンアッセイは、細胞を使用し、これらの3つのステップを統合的に評価できるため、より確実な初期データを得ることが可能です。
レポータージーンアッセイの構成
プラスミド1は、核内受容体の配列が組み込まれており、細胞内で核内受容体のタンパク質を産生させます。この際、核内受容体はLBDは本来の配列ですが、DBDはGAL4という配列のDNAに結合するように組替えた融合タンパクとして発現させます。
プラスミド2は、GAL4配列とルシフェラーゼの配列を持っており、このGAL4の部分にプラスミド1から発現した融合タンパクが結合し、下流のルシフェラーゼ遺伝子を発現させます。
その後、エネルギー(ATP)と基質を与えると、ルシフェラーゼと反応し発光します。この発光量を測定することで活性を判定します。
すなわち、核内受容体とそのターゲット遺伝子を人為的に導入することで、単一の細胞種を用いた一定した条件下で、リガンドと核内受容体の結合、およびその後の転写活性を測定することができます。
なお、それぞれのプラスミドは実験ごとにトランジェント(一過性)に、プラスミドを導入(トランスフェクション)していますので、内部標準プラスミドを同時に導入し効率を規格化しています。また、用いる細胞は、株種、継代数などを厳密に管理しており、測定結果に影響を与える因子を極力排除しています。
実験の構成
お預かりしたサンプルは、毒性のない濃度を確認した後3つの濃度に希釈し、n=3の測定にて発光測定を行います。濃度点数、繰り返し測定回数は、ご要望に応じ変更可能です。
オプションサービス
＊ リアルタイムPCRによるmRNA発現の確認
レポータージーンアッセイでは、模擬的にルシフェラーゼを指標として評価をしておりますが、実際の細胞、組織においてターゲットの遺伝子が発現しているかを、mRNAの発現レベルを測定することによって確認することができます。この場合は、対象となる核内受容体を有する細胞を選定し、細胞にサンプルを取り込ませた後、RNAを回収し、ターゲット遺伝子のmRNA発現量を測定します。
＊ 細胞試験による機能性評価
さらに高次の機能として、細胞機能を指標とした評価系もお受けできます。
解析のお申し込み、お問い合わせ
解析お申し込みの際は、サンプル形態（粉末、溶液、その他）、サンプル数、対象核内受容体をご明記ください。
実験デザインにつきまして、解析担当者より折り返しご連絡差し上げます。